Título: Técnicas utilizadas para detectar glicoconjugados y glicanos en secciones de parafina. Autor: H.J. Aldana Marcos.
Histoinforme. SAH. 12(2): 5-11. 2001.

El siguiente resumen informa sobre las distintas técnicas que puede utilizar el HT para la detección de hidratos de carbono en secciones de parafina. Además nos enseña que la técnica de PAS no sólo demuestra la presencia de hidratos de carbono y que en un trabajo correcto debería comprobarse la especificidad del PAS.


TECNICAS UTILIZADAS PARA DETECTAR GLICOCONJUGADOS Y GLICANOS EN SECCIONES DE PARAFINA:

1-TECNICA DE PAS.


¿El PAS tiñe únicamente hidratos de carbono?


La técnica de PAS (ácido periódico-Schiff) es y ha sido utilizada durante mucho tiempo por numerosos investigadores como método de identificación de macromoléculas con hidratos de carbono, pero como veremos la reacción PAS positiva puede deberse a la presencia de otras moléculas muy diferentes a los hidratos de carbono. Por lo tanto, según Pearse (1985) la especificidad del PAS para la detección de hidratos de carbono no puede ser aceptada sin una cualificación.
Los hidroxilos libres de dos átomos de carbono adyacentes (como los grupos 1,2-glicol de las hexosas) (Fig. 1) de macromoléculas tisulares pueden ser visualizadas histoquímicamente mediante la oxidación a dialdehídos (con el ácido periódico) y posterior condensación de los grupos aldehídos con agentes cromogénicos como el reactivo de Schiff (Spicer et al., 1961, Spicer, 1992). Los grupos hidroxilos adyacentes visualizados por el PAS están presentes principalmente -pero no exclusivamente- en residuos de carbohidratos (Spicer, 1961). Los azúcares pequeños son solubles y, por lo tanto, no resisten los diferentes lavados durante el procedimiento.

 


Figura 1

El resultado positivo puede indicar la presencia de algunos glicanos (polisacáridos) como el glucógeno o de glicoconjugados. Los glicoconjugados (hidratos de carbono unidos a otras moléculas que no son carbohidratos) incluyen a las glicoproteínas, proteoglicanos y a los glicolípidos (Spicer, 1992). Se ha demostrado que con tiempos de oxidación normales el PAS no reacciona con los glicosaminoglicanos (polisacáridos) ni con proteoglicanos (Pearse, 1985; Spicer, 1992). Por lo tanto, la positividad del PAS se debe, en parte, a la presencia de glicoproteínas (neutras o levemente ácidas ) y de glucógeno. A su vez, sólo algunas glicoproteínas neutras son PAS positivas (Pearse, 1985). La reacción se debe a las hexosas presentes en las glicoproteínas ya que las hexosaminas y ácidos hexurónicos parecen no contribuir en la reacción (Pearse, 1985).
Los aminoglicoles presentes en los residuos amino terminales de la serina y treonina de proteínas son susceptibles a reaccionar con el PAS pero generalmente no están presentes en gran cantidad para contribuir significativamente a la tinción (Spicer et al, 1961). Entre otras sustancias PAS positivas pueden detectarse proteínas ricas en residuos de cisteína (Pearse, 1985). A nivel extracelular las glicoproteínas de la membrana basal, las fibras reticulares, las fibras colágenas y ciertas sustancias hialinas son también PAS positivas (Sheehan y Hrapchak, 1980).
Los glicolípidos, fosfolípidos y algunos pigmentos de naturaleza lipídica como el ceroide son PAS positivos. También lo son los lípidos insaturados (Sheehan y Hrapchak, 1980).

Es importante destacar que las diferencias de intensidad de la reacción del PAS de diferentes estructuras en distintos trabajos pueden deberse a varias causas:
a- El fijador utilizado (Sheenan y Hrapchak, 1980). b- La técnica de PAS utilizada (Pearse, 1985). Por lo tanto, no creemos que cuantificar la técnica de PAS sea de importancia, pero sí lo es el hecho de que una estructura dada sea o no PAS positiva. Es útil analizar las diferencias en intensidades de la reacción, sólo si la misma ha sido sometida a diferentes controles o si los tejidos han sido tratados de igual forma.

Sin lugar a dudas es clara la necesidad de realizar otras técnicas con el fin de cualificar los resultados PAS positivos. Por ejemplo:

a) Técnica de PAS sin oxidación previa: permite asegurar que todos los productos PAS positivos son el resultado de una oxidación previa. Por lo tanto se debe realizar un control sin la oxidación previa con el ácido periódico (Martoja y Martoja-Pierson, 1970).

b) Detección de lípidos en cortes de parafina: en general los lípidos son arrastrados por los solventes durante la inclusión en parafina. Sin embargo, no debe descartarse el hecho de que se puedan teñir lípidos insolubles como algunos glicolípidos, fosfolípidos y lípidos insaturados (Spicer, 1992). Los lípidos son extraídos -según Bancroft y Stevens 1990- si se tratan las secciones con una mezcla de cloroformo y metanol o con acetona caliente. La bromación previa a la técnica de PAS puede utilizarse para bloquear los grupos etilénicos PAS reactivos de los lípidos insaturados (Cohn, 1955). La reacción de Schiff con ácido perfórmico para la detección de lípidos insaturados (Sheehan y Hrapchak, 1980) es muy útil si a la vez se realiza un control negativo con bromación.
Para detectar la presencia de lípidos insolubles en cortes de parafina son útiles las técnicas de Negro-Sudan B para cortes de parafina (Pearse, 1985), Klüver-Barrera (1953) para detectar fosfolípidos y glicolípidos -como gangliósidos y cerebrósidos- (Pearse, 1985) y la reacción modificada de Bruckner (Pearse, 1985) para detectar glicolípidos.

c) Comprobación de grupos 1-2 glicol: según Martoja y Martoja-Pierson (1970) es indispensable la comprobación, mediante la reacción de la acetilación reversible, de que el carácter PAS positivo de una estructura se debe únicamente a las funciones 1-2 glicol. Según este autor este punto es verificado mediante el bloqueo reversible de las funciones 1-2 glicol por acetilación con acético anhidro y piridina anhidra. Al acetilarse los hidroxilos vecinos, el ácido periódico no puede actuar y los hidratos de carbono oxidables dan PAS negativos. Mediante la saponificación (desacetilación) con hidróxido de potasio se restaura la PAS positividad de dichas estructuras. Según Hale (citado por Pearse, 1985) la acetilación bloquea todas las sustancias posiblemente PAS positivas y la desacetilación restaura su actividad. Para Pearse (1985) esta reacción carece de fines prácticos, aunque en su libro de histoquímica (apéndice 15, de la parte primera) menciona la técnica señalando que la reacción negativa luego de la acetilación indica la presencia de grupos 1-2 glicol.

d) Presencia de glucógeno: El método más útil para identificar la presencia de glucógeno mediante la técnica de PAS, es tratar los cortes con la enzima diastasa o alfa-amilasa. Estas enzimas despolimerizan el glucógeno formando azúcares pequeños que son extraídos con el agua de lavado luego de aplicar las enzimas. Una disminución o negatividad de la reacción de PAS luego de este tratamiento indica claramente la presencia de glucógeno (Sheenan y Hrapchak, 1980, Spicer, 1992). También existen otras técnicas que permiten detectar la presencia de glucógeno en cortes de parafina. La más utilizada es el carmín de Best (mecanismo empírico). Es selectiva para el glucógeno, aunque también puede teñir suavemente glicoconjugados neutros y fibrina (Bancroft y Stevens, 1990).
Es útil aclarar que los depósitos de glucógeno intracelulares son fácilmente reconocibles en cortes ultrafinos a nivel de microscopía electrónica.

e) Azúcares neutros versus azúcares ácidos: desde el año 1973 Liao y col. (citados por Pearse, 1985) han demostrado que disminuyendo la concentración del ácido periódico puede oxidarse en forma específica los residuos de ácido siálico de los glicoconjugados. Estos residuos son muy comunes en las glicoproteínas (Pearse, 1985) y se ha demostrado que reaccionan más rápido a la oxidación con el periódico que los glicoles de las hexosas, 6-deoxyhexosas o n-acetylhexosaminas de los azúcares neutros (Volz et al., 1987a). La técnica de Volz y col. (1987a) es un excelente método para la oxidación selectiva de ácidos siálicos tisulares con el periodato. Presumiblemente la selectividad a los residuos de ácido siálico de la modificación del PAS realizada por Volz y col., se deba a un incremento en el grado de oxidación de los residuos de siálico producido por una disminución del pH y la baja concentración de periódico del agente utilizado. A su vez, ocurriría una disminución en la tasa de oxidación de los azúcares neutros lo cual produce una concentración insuficiente de grupos aldehídos capaces de ofrecer reacción visible del reactivo de Schiff (Volz, et al., 1987a).


En algunas glicoproteínas ácidas, los carbonos 7, 8 ó 9 de los residuos de ácido siálico pueden hallarse acetilados (Pearse, 1985) y por lo tanto no ser reactivos a la técnica de PAS ni a la modificación de la misma realizada por Vols y col.. Mediante la saponificación con hidróxido de potasio pueden desacetilarse y hacerse PAS reactivos (Culling et al., 1974). Por lo tanto un aumento de la reacción de PAS luego de la saponificación puede indicar la presencia de ácido siálico acetilado (con O-acyl ésteres). No debe descartarse la posibilidad que dicho aumento se deba también a la desacetilación de grupos 1-2 glicol de los azucares neutros (Pearse, 1985). Una forma de reconocer la presencia de ácidos siálicos totales incluyendo los grupos que pueden estar acetilados es sometiendo los cortes a saponificación (remoción de los acetilos) y luego realizar la técnica de Volz y col. (1987a). De forma similar puede reconocerse la presencia de azúcares neutros, bloqueando la reacción del ácido siálico. Las etapas fundamentales son las siguientes (Volz et al., 1987b): I-saponificación con hidróxido de potasio (eliminamos los acetilos presentes en los residuos 1-2 glicol y en el ácido siálico), II-oxidación periódica selectiva según Volz y col. (1987a) (oxidamos a aldehídos, sólo los oxhidrilos de los residuos de ácido siálico), III-reducir mediante la utilización del borohidruro de sodio los aldehídos producidos en la oxidación anterior a alcoholes, IV-realizamos la técnica de PAS (de esta forma sólo reaccionarán los oxhidrilos vecinos de los residuos 1-2 glicol de los azúcares neutros, ya que los oxhidrilos del ácido siálico fueron transformados a alcoholes por el borohidruro de sodio y por lo tanto no son PAS reactivos).

2) TECNICAS QUE UTILIZAN COLORANTES CATIONICOS:

Los glicoconjugados ácidos y algunos glicanos (como los glicosaminoglicanos) pueden presentar en sus macromoléculas (Bancroft y Stevens, 1990; Spicer, 1992):

  1. ésteres ácidos de sulfatos, los que son sumamente ácidos
  2. ésteres ácidos de sulfatos y carboxilos
  3. sólo ésteres carboxilos ácidos, menos ácidos que los sulfatos

Un grupo importante de métodos histoquímicos visualiza los residuos ácidos aniónicos de estas macromoléculas mediante el uso de sustancias coloreadas catiónicas. La más utilizada es el azul alcián.
El azul alcián presenta la particularidad de colorear más intensamente si el colorante es utilizado a un pH en el cual los grupos reactivos se hallan totalmente ionizados (Bancroft y Stevens, 1990). La tinción con el azul alcián a un pH de 0,5 es selectiva para las macromoléculas con ésteres de sulfatos (Lev y Spicer, 1964). A este pH sólo los ésteres de sulfato (muy ácidos) disocian su protón, quedando ionizados. De esta forma al disminuir el pH le quita afinidad al colorante por los grupos carboxilos cuya acidez es menor y por lo tanto no pierden su protón. A pH 2,5 tanto los ésteres de sulfatos como los carboxilos disocian su protón y dan positivos al azul alcián (Lev y Spicer, 1964; Spicer, 1992). Los grupos carboxilos pueden ser bloqueados mediante una metilación suave con ácido clorhídrico y metanol. Si previamente a la reacción del azul alcián pH 2,5 se someten los cortes a una metilación suave, sólo darán alcián positivos los ésteres de sulfato ya que los carboxilos se hallan bloqueados por metil ésteres (Bancroft y Stevens, 1990). Los glicoconjugados y glicosaminoglicanos sulfatados del tejido conectivo también serán metilados, por lo tanto, esta técnica es útil si se desea comparar los glicoconjugados de origen epitelial (Pearse, 1985; Bancroft y Stevens, 1990).


La orceína natural y el azul alcián a pH 2,5 presentan el mismo tipo de reacción tiñendo los grupos sulfatos en los glicoconjugados y glicosaminoglicanos epiteliales y los residuos de ácido sulfónico resultantes de una oxidación de los grupos sulfuros (S-S o S-H) en el núcleo proteico de las glicoproteínas (Singh y Gorton, 1989). Si se combina el azul alcián a pH 2,5 y la orceína es posible diferenciar consistentemente las cantidades relativas de glicoconjugados y glicosaminoglicanos, sulfatados y carboxilados en un mismo preparado (Técnica de Singh y Gorton, 1989). La orceína teñirá de marrón los glicoconjugados y glicosaminoglicanos sulfatados, mientras que en azul se verán teñidos las glicoconjugados y glicosaminoglicanos carboxilados ya que los sulfatados -que también se tiñen con el azul alcian al pH utilizado por la técnica- se ven enmascarados por la orceína natural.
Otra técnica muy utilizada para diferenciar sulfatados de carboxilados es la técnica azul alcián y amarillo alcián (Bancroft y Stevens, 1990). El azul alcián se utiliza a pH 0,5 por lo tanto detectará sulfatados, el amarillo alcián se prepara a pH 2,5 de la misma forma que el azul alcián al mismo pH. El amarillo alcián detectará ambos tipos de ésteres. Resultados: sulfatados en azul, carboxilados en amarillo, células con mezcla de ambos en verde.

3) UTILIZACION DE LA TECNICA DE PAS JUNTO CON EL AZUL ALCIAN.

Esta técnica puede diferenciar fácilmente la presencia de glicoconjugados y ácidos y neutros en un mismo preparado (Bancroft y Stevens, 1990). Consiste en una primera tinción con el azul alcián a pH 2,5, seguida de la técnica de PAS. El uso en primer lugar del azul alcián permite colorear los glicoconjugados y glicosaminoglicanos ácidos. Los glicoconjugados ácidos que puedan reaccionar con el PAS aparentemente son bloqueados por el azul alcián. Por lo tanto, la posterior utilización del PAS sólo reaccionará con los glicoconjugados neutros (Bancroft y Stevens, 1990). Según Spicer (1992) pueden reaccionar también glicoproteínas con hexosas PAS reactivas y grupos aniónicos alcián reactivos. La interpretación de los resultados es la siguiente (Spicer, 1992):

  • PAS+, azul alcián- (color rojo o rosado): ha sido interpretado como indicador de glicoproteínas neutras (raramente glicolípidos insolubles).
  • PAS+, azul alcián+ (el color dependerá de la entidad dominante y puede variar del azul púrpura, hacia el púrpura o al violeta): glicoproteínas ácidas o una mezcla de glicoproteínas ácidas y neutras o una mezcla de glicoproteínas ácidas y neutras más glicosaminoglicanos.
  • PAS-, Azul alcián+ (color azul): se juzgan como glicosaminoglicanos y glicoproteínas ácidas libres de hexosas PAS reactivas. También debe considerarse aquí la presencia de glicoproteínas ácidas con hexosas bloqueadas por la unión del alcián a la macromolécula (Bancroft y Stevens, 1990).

TECNICAS:

PAS según McManus (Pearse, 1985).

1-Hidratar los portas.
2-Acido periódico al 1%- 10´
3-Varios cambios de agua destilada (o agua corriente 5´). Si se usa el agua corriente lavar en agua destilada antes de colocar los portas en el reactivo de Schiff.
4-Reactivo de Schiff – 15´.
5- Agua corriente 10´.
6-Deshidratar y montar.
Si quieren colorear los núcleos, luego del paso 5, colocar en agua destilada y teñir en forma rutinaria con alguna hematoxilina, luego deshidratar y montar.

El mejor y más intenso reactivo de Schiff es el de Tomasi (Pearse, 1985)
Colocar 1 g de fucsina básica en 200 ml de agua destilada hirviendo (ojo sacar un segundo del fuego cuando colocan la fucsina). Mezclar 5´ y enfriar rápidamente (yo lo colocó sobre hielo) hasta exactamente 50°. Filtrar y agregar 20 ml de ácido clorhídrico 1M. Enfriar a 25° y agregar 1 g de metabisulfito de sodio o potasio. Colocar en frasco color caramelo y mantener en la heladera)
Se puede usar así o luego de 14 a 24hs de preparado agregar 2 g de carbón activado y sacudir 1´. Filtrar. Guardar en heladera.

Como comprobar si el Schiff sigue funcionando. Colocar formol puro en un vaso de precipitado y agregar unas gotas de reactivo de Schiff, debe ponerse rojo en 30 seg. Si no lo hace, descartar.

Drogas alternativas para la técnica de PAS

Debido a que la fucsina básica es carcinogénica, se pueden utilizar otros colorantes para la preparación del reactivo de Schiff, estos colorantes serían menos tóxicos.
Según la HT Rosa Villegas de Guidi y el Qco. HT Alberto A. Guidi se logra resultados muy satisfactorios, positivos y reproducibles utilizando la Tionina (Fluka) o pararosanilina (Sigma) para la preparación del reactivo de Schiff. También fue utilizado el Azur II (Fluka) y el violeta de cresilo (Chroma) aunque la reacción fue menos intensa. Salvo la pararosanilina, que determina una coloración PAS+ (rojo-violeta) similar a la fucsina básica. Los otros colorantes tiñen las regiones PAS+ de azul.

Reactivo de Schiff con tionina (Bancroft y Stevens ,1990)
Tionina 2g
Metabisulfito de sodio 3,8 g
Acido clorhídrico 0,15 M 200ml
Dejar en agitador durante 6hs. Agregar 4 g de carbón activado mezclar y filtrar inmediatamente. Guardar en oscuridad y en heladera.

 

Detección de lípidos PAS positivos en cortes de parafina:

a) Extracción de lípidos insaturados.

Tratar las secciones 1 hora en la siguiente mezcla (Bancroft y Stevens, 1990):
Cloroformo 66 ml.
Metanol 33 ml.
Agua destilada 4 ml
HCl concentrado 1 ml.

También puede utilizarse acetona caliente durante 30´.

b) Detección de lípidos insaturados:

Reacción de Schiff con ácido perfórmico (Sheenan y Hrapchak, 1990)
1-hidratar.
2-Oxidación con una solución reciente de ácido perfórmico 2 a 5´. (Lillie los deja durante 90´)
3-Reactivo de Schiff –30´.
4-Lavar en agua corriente caliente -30´.
5-Colocar un cubreobjetos con un medio acuoso (glicerol – gelatina)

Acido perfórmico (este ácido es inestable y se descompone rápidamente):
Acido fórmico 90% 8 ml.
H2O2 30% 31ml
Acido sulfúrico concentrado 0,22 ml

Resultados: lípidos insaturados- magenta.

Bromación previa al PAS (bloqueo de lípidos insaturados):

1-llevar los cortes a xilol.
2-varios cambios en tetracloruro de carbono.
3-1 hora en una mezcla: 39 ml de tetracloruro de carbono y 1 ml de bromo.
4- 2 cambios de tetracloruro de carbono.
5-alcohol 85%- alcohol 70%
6-agua destilada.
7-Reacción de Schiff para lípidos insaturados.
Resultado: el resultado negativo confirma la presencia de lípidos insaturados en la sección.

c) Detección de lípidos con negro sudan B (Pearse, 1985).

1-llevar las secciones hasta alcohol 70%.
2- Teñir durante 30´ a temperatura ambiente en una solución saturada de negro sudán B en alcohol 70%.
3-lavado rápido en alcohol 70%.
4- lavar en agua corriente.
5-montar en glicerina.

Resultados: Lípidos o lipoproteínas resistentes se tiñen de negro o azul.

d) Método de Klüver-Barrera para la detección de fosfolípidos y glicolípidos (Pearse, 1985)
1-llevar las secciones a alcohol 100%
2-teñir con una solución al 0,1% de Luxol fast blue MBS en alcohol 96% de 6 a 18 horas en estufa (56-60°C).
3-Lavar en alcohol 70% y en agua destilada.
4- diferenciar en una solución acuosa de carbonato de litio al 0,05% entre 30´a 2 horas.
5-deshidratar, aclarar y montar.

Resultados: fosfolípidos y glicolípidos en azul.

e) Técnica de Brukner (Pearse, 1985).

1- Aplicar a cortes secos (luego de sacar la parafina) 2 a 3 gotas de una mezcla de 1 ml de una solución acuosa de orcinol al 2% y 10 ml de ácido sulfúrico 2N.
2-Colocarlos en estufa o plancha caliente a 90°.

Resultados: cerebrósidos y gangliósidos en rojo o rojo azulado.

 

Comprobación de grupos 1,2- glicol

Saponificación previa al método de PAS (desacetilación).

1 % de KOH en alcohol 70%, 20´ a temperatura ambiente o 20% de amoníaco en alcohol 80% el mismo tiempo.
Esta reacción es útil para desacetilar grupos bloqueados, si aumenta la reacción de PAS luego de la saponificación puede ser por la presencia de ácido siálico con acetilos que impiden la reacción de PAS ya que la saponificación saca los grupos acetilos de los 1-2 glicoles dejándolos reactivos al PAS.

Acetilación (bloqueo reversible de los grupos 1-2 glicol)


Colocar los portas 1-24 hs en 16 ml de acético anhidro y 24 ml de piridina anhidra. Lavar en agua destilada y realizar el PAS. El resultado negativo comprueba la detección de los grupos 1-2 glicol de las hexosas. Luego desacetilamos con la saponificación y se debería restaurar la reacción PAS positiva.

Como conviene realizar estos procedimientos. Tomar dos cortes del mismo tejido llevarlos hasta agua destilada.
1-Colocar ambos cortes en la mezcla de acetilación, lavar en agua y realizar el PAS en uno solo de los cortes..
2- Con el otro corte, luego de la acetilación colocar en la mezcla de saponificación, y luego realizar el PAS.
Resultados: El primer corte debe dar PAS negativo, el segundo PAS positivo. Esto demostraría la presencia real de funciones 1-2 glicol-

Presencia de glucógeno

Carmin de Best

1. Hidratar las secciones.
2. Teñir con hematoxilina (Ej. la de Harris 2 min)
3. lavar bien en agua de canilla
4. 5-10 minutos con solución de carmín de Best
5. Difreenciar con la solución diferenciadora de Best hasta que la sección quede clara..
6. pasaje directo a alcohol ablsoluto, 2 cambios.
7. aclarar en xilol y montar

Solución de carmín de Best: 2 partes de carmín de Best, dos partes de amoníaco y 3 partes de metanol

Carmín de Best:
Carmín 2 gr.
Carbonato de potasio 1 gr.
Cloruro de potasio 5 gr.
Agua destilada 60 ml
Hervir 5 min y luego agregar 20 ml de amoníaco (mantener en frasco color caramelo (oscuridad) y en la heladera).

Solución de diferenciación de Best: alcohol metílico absoluto 40 ml, alcohol etílico absoluto 80 ml, agua destilada 100 ml.

Azucares neutros y azúcares ácidos:

a) Técnicas de Volts:

I- Detección de ácido siálico total (Volz, et al., 1987a).

1-hidratar.
2-Saponificación con KOH (ver antes)
3-Oxidación periódica selectiva.
Se enfrían los cortes a 4°C y se oxidan con una solución 0,4 mM de ácido periódico en 1M de HCL a 4°C durante 1 hora. Conviene tener antes de usar una solución stock de: HCL 2M y otra de ácido periódico 0,8mM (0,1823g en 1000ml). Ambas se conservan en la heladera a 4°C. Antes de usar mezclar partes iguales para hacer la solución de oxidación suave.
4-lavar en agua destilada a 4°C –10´.
5- Reactivo de Schiff –10´.
6-Agua corriente -5´.
7-Deshidrtar y montar.

Resultados: hidratos de carbono con ácido siálico en rosa.

II- Detección de azúcares neutros (bloqueo del ácido siálico) (Volz et al., 1987b)

1-hidratar.
2-saponificar con KOH 15´.
3-Oxidación periódica selectiva 1 hora a 4°C (igual que en la técnica anterior)
4-agua destilada a 4°C –10´.
5-Reducir con una solución reciente de borohidruro de sodio durante 30´ a temperatura ambiente. (Disolver 1 g de fosfato dibásico de sodio (Na2HPO4 ) e n 100 ml de agua destilada y luego agregar 0,1 g de borohidruro de sodio. El pH de la solución deber ser 9,4)
6- Lavar en agua corriente 5´.
7-Oxidación normal (periódico al 1%) durante 10´.
8-Lavar varias veces con agua destilada.
9- Reactivo de Schiff –5´.
10-Lavar con aguan corriente 5´.
11-deshidratar y montar.

Resultados: sólo azucares neutros en rosa

b) Detección de azúcares con residuos ácidos.

I- Azul Alcián a pH 0,5 y 2,5 (Lev y Spicer, 1964; Pearse, 1985)

Azul alcián pH 0,5
1- hidratar.
2- lavar en una solución de HCl 0,2 M pH 0,5.
3-Azul alcián al 1% preparado en la solución de HCl 0,2 M pH 0,5- 30´.
4-lavar en la solución de HCl.
5-Secar en la estufa.
6-Alcohol 100%- xilol, bálsamo.

Para la técnica de azul alcián pH 2,5, realizar los mismos pasos anteriores pero utilizar una solución de ácido acético al 3%, pH 2,5, para los lavados y para preparar el colorante azul alcián a pH 2,5.

Resultados:
pH 0,5: Glicoconjugados y glicosaminoglicanos sulfatados en azul.
PH 2,5: Glicoconjugados y glicosaminoglicanos sulfatados y carboxilados en azul.

El resultado positivo de los carboxilados puede suprimirse por la metilación de los mismos (Bancroft y Stevens, 1990)

Metilación suave:
1-Tomar dos cortes exactamente iguales.
2-Colocar 1 corte durante 4hs a 37° en una mezcla de 0,8 ml de HCl y 99,2 ml de metanol.
El otro corte (control) se lo deja el mismo tiempo en agua destilada a 37°.
3-Realizar la técnica de azul alcián pH 2,5.
Resultados:
El color azul luego de la metilación indica la presencia de grupos sulfatados, los carboxilos quedan bloqueados.

II- Orceína y azul alcián (Singh y Gorton, 1989)
1-hidratar.
2-Solución de Permanganato de potasio al 0,25% y ácido sulfúrico al 1,25%.-1´.
3-Acido oxálico 2% (hasta que las secciones pierdan el color de la solución anterior)
4-Lavar en agua destilada.
5-4 horas en una solución de orceína (1g de orceína en 100 ml de alcohol 70% más 1 ml de HCl concentrado).
6- lavar en agua corriente.
7-Diferenciar varios segundos en alcohol acidificado (100ml de alcohol 96% más 1 ml de acético puro).
8-lavar en agua destilada.
9-Solución de azul alcián pH 2,5 –1´ a 3´.
10-deshidratar y montar.

Resultados:
La orceína teñirá de marrón los glicoconjugados y glicosaminoglicanos sulfatados, mientras que en azul se verán teñidos las glicoconjugados y glicosaminoglicanos carboxilados ya que los sulfatados -que también se tiñen con el azul alcián al pH utilizado por la técnica- se ven enmascarados por la orceína natural.
La orceína también tiñe las fibras elásticas.

III- Azul alcián y amarillo alcián (Bancroft y Stevens, 1990)
1-Hidratar
2- Lavar en una solución de HCl 0,2 M pH 0,5.
3-Azul alcián al 1% preparado en la solución de HCl 0,2 M pH 0,5- 30´.
4-lavar en la solución de HCl.
5- Agua destilada.
6-Alcián amarillo (Alcián amarillo 1 g en 100 ml de ácido acético al 3%. pH 2,5) 5´
7-Agua destilada.
8-deshidratar (o secar en estufa).
9-xilol-bálsamo.

Resultados: sulfatados en azul, carboxilados en amarillo, células con mezcla de ambos en verde.


e)- PAS y azul alcián (Bancroft y Stevens, 1990.)
1-hidratar.
2-Azul alcián pH 2,5 -5´.
3-Lavar con agua corriente y luego con destilada.
4-Acido periódico al 1% -10´.
5-Lavar bien en agua destilada.
6-Reactivo de Schiff (Tomasi) –15´.
7-Agua corriente – 10´.
8-Deshidratar y montar.

Resultados:
PAS+, azul alcián- (color rojo o rosado): ha sido interpretado como indicador de glicoproteínas neutras (raramente glicolípidos insolubles).
PAS+, azul alcián+ (el color dependerá de la entidad dominante y puede variar del azul púrpura, hacia el púrpura o al violeta): glicoproteínas ácidas o una mezcla de glicoproteínas ácidas y neutras o una mezcla de glicoproteínas ácidas y neutras más glicosaminoglicanos.
PAS-, Azul alcián+ (color azul): se juzgan como glicosaminoglicanos y glicoproteínas ácidas libres de hexosas PAS reactivas. También debe considerarse aquí la presencia de glicoproteínas ácidas con hexosas bloqueadas por la unión del azul alcián a la macromolécula (Bancroft y Stevens, 1990).

Bibliografía:

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Dr. Hernán Aldana Marcos.
Prof. Titular de Histología-Embriología.
Facultad de Medicina. Universidad de Morón.
hernanjavier@yahoo.com

 

 

 

 

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